L'interno è una grande sala dominata dal ciclo di affreschi a diciassette pannelli su La vita di sant'Agostino attorno all'altare maggiore, dipinto da Benozzo Gozzoli tra il 1463 e il 1467. Nello stesso di Sant'Agostino, Benozzo creò un affresco votivo, San Sebastiano, commissionato dagli Agostiniani in seguito alla pestilenza che colpì la città nel 1464.

In occasione della peste, che infuriava in quell'anno. Il Santo, vestito e senza I segni del martirio, che col manto ricopre e protegge dall frecce - scagliate dall'ira di Dio - il popolo di San Gimignano. E' un motivo di antica tradizione umbra. Alla tradizione toscana si ricollega in alto duplice intercessione del Cristo, che mostra piaghe, e della Madonna, chè mostra il seno, indice del suo materno amore verso l'umanità. Nella predella al centro della quale v' è Cristo crocifisso, circondato dai santi Nicola da Tolentino, la Vergine, Giovanni Evangelista c Agostino, in ginocchio è il committente Fra Domenico Strambi. Nel tondi i santi Giuliano, Antonio abate, Giovanni Battista. Domenico, Giusto, e Agata.