L'interno è a tre navate, scandite da colonne che ricordano le pievi del Casentino, con volte a vela affrescate e con intonaco dipinto alle pareti. La chiesa è decorata da importanti cicli pittorici che coprono tutte le pareti, uno ciclo risalente a più secoli ma molto raro nella sua completezza.
La zona centrale interna della controfacciata è dominata dall'affresco raffigurante il Martirio di San Sebastiano, datato 1465 e firmato da Benozzo Gozzoli; l'affresco è inserito in una cornice decorativa in cui sono dipinte delle piccole figure di Santi mentre in basso è collocata la figura di Gesù Crocifisso fra San Girolamo e Sant'Onofrio. Sulle due mensole ai lati, davanti a finti tappeti damascati, si trovano le pregevoli statue lignee dell'Arcangelo Gabriele e di Maria Annunciata, che formano il gruppo dell'Annunciazione di Jacopo della Quercia (1421 con la colorazione di Martino di Bartolomeo del 1426).
In questo affresco il Santo è raffigurato secondo la tradizionale iconografia, vestito solo con il perizoma e trafitto da un gran numero di frecce, simbolo della pestilenza, scagliategli contro da baldi arcieri. Come nella chiesa di Sant’Agostino Benozzo raffigura Sebastiano sopra un piedistallo marmoreo, questa volta con un’evidente volontà di assimilare il santo alla figura di Gesù; la posa, infatti, è analoga a quella del Cristo flagellato che soffre per la salvezza dell’umanità. Nel registro superiore sono raffigurati Gesù e la Vergine Maria, nell’atto rispettivamente di benedire e di pregare, circondati da un’ampia schiera di cherubini e serafini; immediatamente sopra la figura di san Sebastiano due angeli stanno incoronando il Santo.(2)
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